[МУЗЫКА] [МУЗЫКА]

В этой лекции мы поговорим про перспективы использования системы CRISPR/Cas.

Эта лекция будет содержать все самое интересное.

Начнем с узнавания ДНК.

Вы помните, что белок Cas9 из бактерии Francisella

novicida способен узнавать РНК и разрезать РНК.

Это использовалось на примере для «лечения» от вируса гепатита C.

Однако белок Cas9 из Francisella novicida может узнавать не только РНК,

но и ДНК, просто у него такой приятный «бонус» — узнавание дополнительно РНК.

Поэтому, конечно, шел поиск и других белков, обладающих похожими функциями.

И такой белок был найден.

Белок C2C2 способен узнавать специфически РНК,

его можно использовать для лечения от вирусных заболеваний.

Я не знаю, почему его назвали C2C2, но мне кажется,

что вообще в мире все связано, и сейчас я это покажу.

C2C2, да?

О!

C2C2 C3PO R2D2.

Так я и думал.

Ну, продолжаем.

Очень часто возникает вопрос: а какие гены задействованы в какой-то функции?

И вообще, какая функция конкретного гена?

Ну например: есть люди, которые больны определенным видом рака.

Им назначается препарат, который излечивает 70 % пациентов,

но почему-то 30 % не излечивает.

То есть опухолевые клетки могут быть устойчивы к противоопухолевому препарату.

Из-за чего?

Очень часто это связано с тем, что у них, например, выключены

какие-то гены или активно работают те гены, которые не должны работать.

Каким образом можно узнать,

какие гены отвечают за устойчивость к препарату против рака?

Ну, можно перебирать гены по одному — это очень долго,

а можно — одновременно определить функции всех генов,

точнее, участвуют ли они в устойчивости к препарату.

Как это сделать?

Ну например, можно выбрать 7000 генов, сделать 73 000 химерных

направляющих РНК, заразить культуру клеток, миллионы клеток этим РНК.

То есть на каждый ген будет по 10 химерных направляющих РНК — в какой-то клетке

гарантировано одна из них сработает, и ген будет выключен.

Еще можно взять практически все гены — 18 000 генов, сделать на них, например,

64 000 химерных направляющих РНК, ну, с той же идеей.

Конечно же, вопрос возникает доставки — с помощью лентевирусов.

Сначала нужно синтезировать химерные направляющие РНК,

затем их нужно заклонировать в плазмиду, а плазмиду упаковать в лентивирусы.

Если в клетку одновременно попадет несколько лентивирусов, выключится

несколько генов, мы уже не будет знать, какой из них отвечает за функцию.

Поэтому нужно развести, разбавить лентивирусы так,

чтобы в каждую клетку попадало меньше, чем одна вирусная частица в среднем.

Допустим, на две клетки будет одна вирусная частица.

И начинаем исследовать.

Как? Например, пусть это будет линия раковых

клеток, и мы хотим определить, а почему же она устойчива к лекарству от рака.

Обрабатываем несколько миллионов лекарством,

несколько миллионов не обрабатываем.

Клетки растут, например, неделю, а потом берем и секвенируем — секвенируем

не геномы, секвенируем конкретно вот те самые участки,

которые мы ввели в клетку, которые содержат направляющие химерные РНК.

Здесь направляющие химерные РНК — это такой баркод, то есть это такая метка.

Помните, в магазинах, в супермаркетах на ценниках есть такие полосочки?

Они позволяют очень просто компьютеру считать информацию и определить,

что ж это за товар.

Точно так же мы можем каждую клетку уникально замаркировать.

Когда мы вносим конкретную молекулу — химеронаправляющую РНК — в геном клетки,

кодирующий ее, это молекула — уникальна, и мы можем,

подобрав праймеры с двух концов, амплифицировать ее.

Затем отсеквенировать, определить последовательность —

и мы будем точно знать, какой ген мы в этой конкретной клетке выключили.

Хорошо, у нас есть миллионы клеток, обработанных лекарством,

необработанных лекарством.

Что дальше?

После секвенирования мы смотрим: а пропали ли какие-то баркоды?

Например, пропадание баркода может говорить о том,

что клетки с этим баркодом не выжили.

Почему они не выжили?

Может быть, эта функция, функция этого гена абсолютно необходима для клетки.

Например, есть так называемые гены «домашнего хозяйства» — даже, наверное,

без кавычек, — гены «пылесоса», например.

Шучу.

Если выключить гены синтеза РНК, гены,

необходимые для синтеза ДНК, клетка погибнет.

Таким образом — негативная селекция.

Может быть другой вариант — позитивная селекция.

Мы обработали часть клеток препаратом противоопухолевым,

другую часть клеток не обрабатывали.

По сравнению с теми, которые мы не обработали, контроль нужен всегда,

оказывается, что некоторые баркоды — их количество увеличилось,

то есть число клеток, несущих определенные баркоды, увеличилось.

Значит, число клеток, в которых мы выключили конкретный ген,

почему-то стало больше после обработки препаратом — они не умерли.

С чем это может быть, что это могут быть за гены?

Ну, есть такие гены как бы «онкосупрессоры».

Они, конечно, их цель не в том, чтобы подавить опухоль, а например, в том,

чтобы клетка ловила, понимала сигнал от соседей.

Клетка делится, но в какой-то момент наступает ситуация,

когда она понимает: «Ага, вокруг меня уже много клеток, они все дают сигналы,

значит, делиться надо прекращать».

Часто опухоли этих сигналов не чувствуют и продолжают расти бесконечно.

Такие гены можно условно называть «онкосупрессорами».

И конечно, если выключить такой ген, то это даст преимущество раковой клетке.

Таким образом, с помощью такой позитивной селекции система маркирования на миллионах

клеток всех генов, ну или выключение всех генов поодиночке в каждой клетке,

позволяет нам определить, какие гены нужны, например, для того,

чтобы клетка была устойчива к препарату против опухоли.

В чем преимущество такого полногеномного скрининга,

когда мы не перебираем все по одному?

Во-первых, мы можем скринировать все сразу — это быстро, хотя и дороже.

Во-вторых, мы можем исследовать не только экзоны — биокодирующие части генов,

но также нарушать функционирование промотеров, энхансеров,

межгенных промежутков, интронов — и все это одним и тем же методом.

Кроме того, мы анализируем выключение генов на уровне ДНК.

Есть технологии, которые позволяют подавить РНК конкретного гена в клетках,

но это как вычерпывать воду из колодца или даже насосом ее убирать,

она все равно появляется — гены-то мы из генома не удалили.

Поэтому, конечно, эффективней выключить ген вообще.

Ну и наконец, эта технология позволяет искать и новые функции генов,

и вообще функции генов.

Для части генов нашего организма мы не знаем, зачем они нужны.

Такое скринирование может нам помочь.

Еще одно интересное применение системы CRISPR/Cas — это

включение гена без модификации ДНК.

Как вы помните, белок Cas9 состоит из разных доменов,

в том числе двух доменов-ножниц, которые разрезают ДНК.

Эти домены...

можно изменить аминокислотную последовательность и выключить ножницы.

Белок все так же будет искать определенное место ДНК, которую мы программируем с

помощью химерной направляющей РНК, однако разрезать ДНК не будет.

А к такому белку Cas9 мы можем пришить, например, активатор транскрипции — белок,

который будет активировать транскрипцию гена, экспрессию гена.

К чему это может привести?

В одной из работ было сделано 70 000 химерных направляющих РНК на все гены,

что потенциально позволяет включить все гены,

ну или по крайней мере включать все гены.

И оказалось, что усиление экспрессии с помощью белка Cas9 и активатора

транскрипции может производиться буквально на четыре порядка, то есть ген почти не

экспрессировался или не экспрессировался, и в четыре порядка возросла экспрессия.

На картинке вы видите экспрессию генов, транскрипционных факторов,

которые активны в разных типах стволовых клеток.

Вообще, стволовые клетки — это модная тема,

поэтому именно эти гены там и показаны.

Кроме того, можно одновременно доставить в клетку 10 разных химерных

направляющих РНК и одновременно, чуть с меньшей эффективностью, включить 10 генов.

То есть мы можем по желанию включать гены.

Для чего может быть нужно включение генов?

Есть такое заболевание — это миопатия Дюшена.

Оно достаточно редкое,

встречается у одного человека из 3600, при этом у мужчин.

Оно вызвано тем, что не синтезируется один белок — дистрофин.

Из-за этого происходят дистрофические изменения в мышцах и очень неприятные

проблемы.

Оказывается, нам не нужно даже исправлять мутацию,

не нужно заставлять клетку синтезировать дистрофин.

Для того чтобы убрать большинство симптомов, нужно всего-навсего увеличить

синтез другого белка — утропина — и компенсировать недостаток дистрофина.

Это можно сделать с помощью Cas9 и активатора транскрипции.

Единственная проблема, говоря про клеточную терапию — это доставка пациенту.

Мы можем также выключать гены: убрать ножницы,

порезать их, а добавить репрессор транскрипции,

то есть какой-то белок, который каким-то механизмом уменьшает транскрипцию.

Мы можем таким образом выключить гены, но не навсегда — без порезки его ДНК.

Давайте немножко остановлюсь на том, как это можно сделать.

Вы помните все про генетический код.

В ДНК закодирована последовательность аминокислот белков.

Например, триптофан кодируется тремя буквами — это ACT.

Всего в геноме кодируется 20 аминокислот — это почти правда.

А триптофан в добавок — это незаменимая аминокислота.

Лирическое отступление — использование «Википедии».

Если посмотрите на список незаменимых аминокислот — что это такое?

Аминокислоты, которые нам необходимо каждый день потреблять с пищей,

мы не можем их сами синтезировать.

Окажется, что в русской «Википедии» написано о восьми

незаменимых аминокислотах, а в английской — о девяти.

Учите английский.

Как и генетический код, существует еще гистоновый код.

ДНК не просто существует в клетке, она существует компактно.

Мы не можем два метра человеческой ДНК запихать в 10 мкм ядра,

чтобы не было путаницы.

Первый уровень упаковки — это нуклеосомный.

Есть 8 гистонов, такой core, или центр, на который наматывается почти два витка ДНК.

От этих гистонов отходят хвосты —

аминокислотные последовательности, которые можно модифицировать.

На них можно навесить метки метильной группы, убиквитин.

Так вот, такие модификации могут регулировать экспрессию генов.

Они могут говорить белкам, которые приходят, чтобы делать транскрипцию,

транскрибировать ген: «Так, этот ген не трогаем, он должен быть неактивен».

Или, наоборот: «Этот ген должен быть активен».

Подвесив, присоединив такие белки — активаторы,

репрессоры транскрипции — к белку Cas9, мы можем в месте,

в специфическом месте ДНК редактировать уже гистоновый код,

то есть эпигенетические метки.

И таким образом мы можем изменить экспрессию, изучить,

как влияют вообще, как влияют такие метки гистонов на экспрессию гена.

Мы можем создать новые генетические сети, мы можем создать новые взаимодействия

между генами, то есть, вообще, это очень интересная технология,

в которой опять же мы можем использовать белок Cas9 или в целом систему CRISPR/Cas.

5.10. Перспективы

ГМО: технологии создания и применение

Meet the Instructors