0:00
[МУЗЫКА] [МУЗЫКА]
«ЛАБОРАТОРНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ БИБЛИОТЕКИ ГЕНОМОВ И СЕКВЕНИРОВАНИЯ» Для
дальнейшей подготовки ДНК библиотек для полногеномного секвенирования нам
необходимо оценить количество и качество ДНК, которое мы только что выделили.
Для этого нам понадобится следующее оборудование: спектрофотометр,
камера для проведения электрофореза и система гель-документации.
И компьютер.
Для определения количества ДНК в нашей пробе нам необходимо использовать
спектрофотометр.
Принцип метода заключается в следующем — ДНК определенным образом поглощает
ультрафиолет.
В приборе спектрофотометре ДНК подвергается воздействию света
длиною 260 нанометров, а фотодетектор определяет количество света,
прошедшего через образец.
Чем больше света поглощено, тем выше концентрация ДНК в нашем образце.
Часто образцы ДНК могут иметь примеси белков и других органических молекул.
Отношение поглощения при длинных волн 260 и 280 используют для
оценки частоты препарата.
Так же другие молекулы органические соединения поглощают при длине волны 230,
таким образом соотношение 260 / 230 тоже показывает нам качество ДНК препарата.
Давайте посмотрим, как измеряется концентрация ДНК с использованием этого
спектрофотометра.
Включаем прибор.
Будем использовать один пьедестал, несмотря на то, что у нас их 8,
для измерения концентрации.
Наносим воду.
Нажимаем OK.
Теперь мы будем наносить буфер, в котором мы растворили нашу пробу ДНК.
Вносим название пробы.
И измеряем.
Прибор только что измерил концентрацию ДНК в нашей пробе.
Мы видим, что соотношение 260 / 280 у нас составляет 1,8.
В принципе, является достаточно хорошим показателем.
А количество ДНК в пробе составляет 399 нанограмм в микролитре.
Для того чтобы оценить качество пробы ДНК, то есть понять,
насколько она является целостной, оценить ее размер,
мы будет проводить аналитический электрофорез в агарозном геле.
Этот гель является своеобразным молекулярным ситом, при приложении
электрического тока более длинные молекулы движутся в геле медленнее,
а более короткие молекулы движутся быстрее.
Ну сам по себе гель просто содержит полости, которые мешают движению больших
молекул, и наоборот, движение маленьких молекул намного проще.
Электрофорез является аналитическим методом,
который позволяет разделять молекулы ДНК в электрическом поле.
Сами по себе молекулы ДНК заряжены отрицательно, и поэтому
при использовании электрического поля в растворе ДНК начинают движение от катода,
заряженного отрицательно, к аноду, заряженного положительно.
Электрофорез проводят в камере, заполненной буфером.
Буферный раствор необходим для повышения ионной силы раствора,
в котором будет происходить разделение молекул ДНК.
Для того чтобы оценить размеры и качество ДНК, которую мы разделили в геле,
мы будем использовать специальный интеркалирующий краситель, который
флюоресцирует при ультрафиолете, и далее, используя систему гель-документации,
мы сможем увидеть вообще сам продукт нашей работы.
Определение размеров фрагментов ДНК, которые мы анализируем при электрофорезе,
проводят путем сравнения стандартами длины.
Это обычно коммерчески доступные стандарты,
которые содержат в себе линейные фрагменты ДНК разного размера.
Начиная от 100 до 10 000 пар нуклеотидов.
Давайте сейчас ознакомимся с тем, как нужно проводить электрофорез ДНК.
Возьмем расплавленную агарозу, установим
гребенку и зальем расплавленную агарозу в специальную плашку для геля.
Ждем пока гель застынет, это занимает 15 минут.
После того как гель застыл, вынимаем гребенку.
И переносим плашку с гелем в камеру для электрофореза.
Камера уже содержит буферный раствор.
Вот.
Он покрывает гель полностью.
Теперь мы должны нанести в лунки геля образец ДНК, смешанный с красителем,
и стандарты размеров.
Смешиваем образец ДНК с красителем для нанесения.
Вот образец ДНК.
Добавляем туда краситель.
Пробу, смешанную с красителем
для нанесения, наносим в лунки.
Добавляем стандарты размеров.
Его мы добавляем в соседнюю лунку.
Включаем источник питания и ждем около часа.
Спустя час мы останавливаем процесс электрофоретического разделения ДНК.
Вынимаем гель.
[БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ
СЛОВ] И идем к системе гель-документации.
Система гель-документации облучит наш
гель ультрафиолетовым светом и мы сможем сфотографировать продукты разделения ДНК.
Включаем прибор.
Мы видим результат электрофореза, который мы только что провели.
В левой дорожке результат разделения стандартов размеров.
Каждая полоса соответствует определенному размеру ДНК.
Самая нижняя полоса соответствует размеру ДНК 300 пар нуклеотидов,
самая верхняя полоса соответствует размеру ДНК 10 000 пар нуклеотидов.
В правой дорожке результат разделения нашей пробы,
содержащей геномную ДНК Escherichia coli, сейчас можно сказать о том,
что эта ДНК не содержит примесей РНК и имеет достаточно большой размер для того,
чтобы проводить полногеномное секвенирование.
Проведя количественную и качественную оценку ДНК,
мы можем использовать ее, во-первых, для проведения полногеномного секвенирования,
и эта процедура будет показана далее, а также можем заложить ДНК для длительного
хранения, чтобы потом использовать ее для повторного секвенирования или
более подробного изучения определенных участков генома.
Для сохранения ДНК высокого качества рекомендуются следующие условия.
Для кратковременного хранения в течении недели ДНК хранят при +4
° в буфере Tris-EDTA.
Для более длительного хранения в течении месяцев можно хранить ее
при −20 ° тоже в буфере Tris-EDTA, ну а в течении нескольких лет
ДНК можно хранить при −80 ° в буфере Tris-EDTA или под этанолом.
[МУЗЫКА]
Alla L LapidusProfessor, Department of Cytology and Histology
Николай Вяххи
Павел ДобрынинМладший научный сотрудник
Михаил РайкоПостдок
Екатерина ЧерняеваПостдок
