好,那么我们学会了这个果蝇的
雌雄识别,也知道了这个果蝇的生活史
然后呢也学了如何来 做杂交分析。
如果你要 现在进行一个,就是说研究的话
最开始应该从哪儿入手呢?我们在前边的那个
思考题里边,陆续地呢给大家有一些针对性的 思考题,那么这里呢我会给大家举两个例子
一个呢是从正向遗传学筛选的策略 一个是反向遗传学筛选的策略,然后呢给大家讲一下
我们这两个例子都是 前几年我们曾经给咱们本科的学生做过的
由于这个每年的这个情况 不太一样,时间或者是这个评析,或者我们
合作的对象不一样,所以的话我们呢就是说并不一定都集中到一年 来全部上。
但是呢,就是说 虽然我们今年有一些实验呢没有亲自去做,但是呢
那个给大家讲一下,然后呢从思路上呢给大家有一个 认识。
好 我们现在呢就以这个正向遗传学策略,也就是说我们用
EMS 这个诱变,这样一个思路 来作为起点来进行研究。
好 那么 EMS 诱变然后处理果蝇,然后呢我们目的呢是要拿到
不同的突变体,是吧?好,那么这样的
这个突变体的话,最终我们要想办法知道它是哪个基因
造成了突变了,对不对?所以呢,就是说
最好是在处理的时候呢,我们最开始呢就有一个标记,然后呢我们将来呢
确定这个基因是哪个基因,或者是位于哪条染色体上 就给我们一个很好的线索。
所以,我们现在呢 这个例子
就是 EMS 筛选的这个果蝇,我们本身是什么?带着 FRT 的
我们刚刚学了 FRT,还有 FLP,然后呢 就是说用这样的策略,用这样的方法,可以解决什么样的问题
所以呢,我们在一开始呢这个果蝇,被处理的这个突变果蝇 就带着 FRT。
这样给我们带来什么好处呢? 就是说我们将来,这个我们不同染色体
上都有 FRT,是吧,如果我们针对某一条染色体
将来呢,我们就可以筛选这条染色体上 的突变基因
好,呃 EMS
诱变的话 原理呢,我这里简单地给它介绍一下
实际上呢,它是什么呀?它是将这个碱基 这里是一个这个鸟嘌呤。
碱基的这个 这叫什么,CII
这个位置 然后呢,EMS诱变以后呢,就会发生一个烷基化
好,出现了这种情况的时候呢,它的配对呢 就会出现问题了。
本来 G 应该是跟 C 配对,现在呢,烷基化以后呢? 它反而是跟胸腺嘧啶来结合了。
好,那么如果是 胸腺嘧啶被 EMS
诱变以后呢? 同样,也是在这个 CII
的这个位置,然后呢也会出现烷基化 那本来它应该是跟什么?跟
A 配对的,那现在呢,出现了它跟 C、 G来配对了
所以的话,这个发生的是什么?点突变 就说
EMS 诱变呢 造成的是碱基的点突变。
碱基点突变的话 这是一种什么突变呢?是
嘌呤变成嘌呤,还是嘌呤,这是什么?转换
如果是嘌呤变成嘧啶的话,突变上叫什么 颠换。
所以现在我们发生的呢,是转换的突变,那么这个转换突变的话,它就会到时候呢
出现什么,移码突变或者是无义的突变。
这样的话就会整个这个氨基酸 的这个表达、 翻译的时候呢就会有问题。
然后呢跟原来的衍生型的 这个翻译出来的蛋白就完全不一样了。
好 另外呢,也有一些在染色体水平上发生的变化
但是呢,在染色体水平上结构方面发生的变化的话,这个比较少见 所以嘛,主要是点突变。
好,这就是它的那个 对基因组造成影响的基本原理
好,我们在处理果蝇的时候呢,一般的流程呢是这样的
也就是说,比方说我们选的是三号染色体,而三号染色体上呢我们带着 FRT 左右 B 都有。
好,我们把这样的果蝇 然后呢,选出雄性的果蝇来
然后呢,单独地培养三天
目的是将来交配的时候呢,它的成功率更强一些
然后另外呢,我们三天以后呢,让这个果蝇呢饥饿两个小时
不要给它喂食,放到一个空瓶里边。
好,然后呢 再把它放在里边加了这个
EMS 的 培养基,然后呢,在这里边呢放大概 18 个小时
就说让它那个自己取食,就可以起到这个作用了 好,18
个小时以后呢,我们把它转到一个新的果蝇瓶里边 然后呢,下边有培养基,然后这样的话两个小时
一到两个小时之内呢,让它呢在里边呢,把身体上边粘的这些 EMS
的话,给它清理一下 然后呢,我们转到一个新的培养瓶里边,让它跟相同基因型的
果蝇来杂交,产生后代 好,这是整个这个处理的一个过程
当然这个过程当中的话,就是说有关使用,如何来使用这个 EMS,然后呢
怎么来这个注意安全的问题,然后呢相应的呢 我们都要按着,严格地按着这个规程来进行操作
好,那么 杂交以后,这个是
被 EMS 诱变处理的果蝇 是雄性的果蝇,然后呢处理以后呢,我们引入
这样的果蝇进行杂交 那么,杂交以后,实际上呢它的后代
这个果蝇的后代,也就是说它的那个
精子,我们选的是雄性的,它的精子如果是产生突变了
然后呢,在这一代呢才可以看得出来的 好,所以呢,你看我们现在
跟它杂交的这个果蝇,大家注意了没有 这个上边呢用的是
D 级染色体的平衡染色体 Tb 和 Sb 是哪个染色体上的标记基因呢
第三平衡染色体上的标记基因,是吧?所以呢我们处理的时候,是处理的 EMS
处理呢,是第三染色体上带着 FRT 的果蝇
是吧,我们在杂交的时候呢,只用 第三染色体的平衡染色体来跟来跟它杂交,最终我们在后代的时候呢
选,是选什么呢?选,只选在第三染色体上发生突变的
那些个体,我们先不考虑第一染色体和
第二染色体,我们如果做完第三染色体以后
我们还觉得有必要,没有筛选到我们想要的东西,我们还可以 相同的程序,然后呢,我们再用第二染色体带 FRT
的、 这样的果蝇进行 EMS 处理 或者是第一染色体,我们分别地一个一个来。
好 那么,这样的这个果蝇出来以后呢,我们呢单个单个的果蝇
因为每个果蝇都是 一个精子传下来的,是吧,然后呢我们就要看这个
单个单个的果蝇,究竟是哪个果蝇发生了 这个突变了。
好,然后呢我们再把第三号染色体 的平衡染色体,这样的雌性果蝇呢跟它杂交。
在这个时候呢,我们实际上呢是获得什么 获得了这个突变果蝇既有雌的,也有雄的
这样的话,我们再下一代的话,让杂合体自交
最终呢就可以拿到纯合的突变体了,是吧?
那个有关的这个详细的杂交的这个图的话,你们回去以后呢
可以仔细地自己琢磨一下,看一看,这个原理上呢应该是很简单的
那么而且呢,我们用到了前面我们所用的 所学过的,然后呢这个平衡染色体
好,那么这里呢我们当时
这个实际上就是说在处理果蝇的时候的这个时间的这个顺序 那么大家呢在做杂交的时候呢,就要
所有的这个步骤,杂交图也画出来,然后呢
这个时间点要算出来,你要什么时候
去选果蝇,什么时候要准备好处女蝇
这个所有的呢都要按照这个杂交的这个程序以及发育的时间段 来,然后来控制这个所有的这个整个的杂交的过程
所以的话,整个的这个杂交的这个 程序的话一定要仔细地计算,否则的话,时间
杂交的时间跨度这么长,然后呢你每个环节,某个环节如果是 这个考虑地不周、
不仔细,然后呢选的量不够,最终呢 经过这么长时间,最终呢你是拿不到你所想要的结果的
好,那么
我们刚才通过杂交,然后呢拿到了很多
突变体,是吧?不同的果蝇,然后呢我们不同的瓶,然后呢是不同的这个
后代,就是说传下来的,然后呢它的基因型应该是不一样 的,就是说
EMS 诱变,究竟诱变影响到哪个基因?
我们是不知道的,但是呢我们前面的这个杂交 已经是建立了,相当于建立了一个库,突变体的库
好,这个时候的话,我们就要做什么呢?我们就要做,看它的表型究竟是什么
怎么看呢?好,你们可以看一下 我们最开始的果蝇,这个果蝇的
第二,第三染色体上带着一个 FRT
的位点,是吧?而这个上边呢又带着突变 而且呢,我们当时用的这个平衡染色体呢是第三染色这个平衡体
平衡染色体,是吧?所以呢我们拿到的这个突变品系呢就是这样一个基因型的品系
而且呢这个突变体是很多个不同的瓶,是吧?我们分别 把这样的突变体跟另外一个果蝇杂交
另外一个果蝇呢同样也带着 FRT 好,这样的话,同源
然后呢在 FLP 的作用下,它就会发生
重组,是吧?然后呢经过有丝分裂,然后呢我们刚刚上次讲过 然后呢就会在某个地方形成
纯合突变的克隆,是吧?好,那么 你如果是想研究翅膀里边的
想在翅膀里边看这个突变,我们就加,在这个 FLP
前边呢 加一个翅膀特异的基因它的 Promoter。
如果呢你感兴趣的是眼睛里边的 或者是神经细胞里边的,就看你感兴趣的是什么,你呢 FLP 呢就用那样的
Promoter 然后呢这样的世界就会发生在那样的组织或者细胞里边去
你针对性地就可以去观察,好
我们观察的时候呢,有一些呢是可以看到
表型的,肉眼可以看到的,但是呢有一些呢是肉眼看不到的 所以呢,我们在最开始设计的时候呢,好
把一个 GFP 这样的元件也装进去
也就是说我们感兴趣的这个表型 其实呢已经 GFP
标记了,所以呢我们在荧光镜下边呢也可以看到 这个突变的表型的。
好,那么这里呢 就是一个在翅膀上边我们
既表达 GFP 又让 FLP 起作用,然后呢会 形成这个
Mosaic 的克隆,这样 的一个杂交实验。
好,那么后代的话 有四种个体,那么当然 这个 Sb
/ Sb 的呢纯合致死的 那么这两种表型,这两种个体的话,因为只有一个染色体上有
FRT 是吧?所以的话,它们两个呢不会出现 这个 Mosaic 的克隆的。
好,只有这样的个体才会 看到表型。
那么看到的表型呢因为是在翅膀上面,是吧?所以 呢我们去观察翅去,然后呢因为是第三染色体,我们呢还有一个标记基因呢
就是什么呀?其实呢这个时候呢,这样的个体呢
刚毛是正常的,而不是短刚毛的,而其它两种个体呢是短刚毛的 你们可以看这个设计的时候呢,我们用了
前面学的所有的东西,而且呢,后代呢每一种基因型我们都可以明明确确地区分开来
好,最终我们
看到什么呢?大家可以看一下,我们在翅膀上面,这是野生型的
翅膀上边呢,如果是出现这样的表型 翅膀边缘有缺刻
这样的表型实际上呢是跟 Notch
信号相关的 这是前人已经研究过的,你们听说过吗?
Notch,没有,好,没关系,那个以后呢你们学的时候呢都会
遇到,这是很常见的一个 passway
的基因 好,那么如果是这个翅膀的中间
也就是说这个 L3 和 L4 这两个翅脉
出现什么问题的话,其实呢是跟什么呀? Hedgehog 这样的
passway 相关的 好,那么如果是翅脉的边缘,你看,这个边缘的这个
翅脉都没有了 如果出现这样的表型的话,实际上是什么?是跟
Wingless 相关的 所以通过这样的表型分析
我们就可以找到我们感兴趣的这个
基因,那么感兴趣的这个突变呢 也许是已知的基因
也许是未知的,那未知的基因呢那就是我们所感兴趣的东西,新的基因
而且呢是跟这个信号相关的,好 但是呢,如果我们在这个
成体的翅膀上边看不到表型 但那样的个体呢并不见得是没有表型的
好,那我们就可以呢看它的幼虫 然后呢幼虫的成虫盘我们上次给大家演示过,就是说
在幼虫期的时候呢,我们就看到有一个 成虫盘将来呢会发育成翅膀的。
好,在这个 翅膀上边的话,你用 GFP
标记了,所以呢我们在荧光镜下边呢就可以看到 这个没有被
GFP 标记的这些白色的 框起来的这些区域呢就是纯合突变的那个区域
好,那么另外的这些 GFP 标记的这些呢它是
非突变,就非纯合突变的那些克隆 好,一般情况下的话,我们这个
做这样的研究分析的时候呢,带突变的
这个果蝇上边呢一般不带这个标记基因
所以呢最终呢出来实际上是空白的地方呢是,非 GFP
的地方呢是 突变的区域,而另外一个果蝇上边呢
带着标记基因,这样的话出来以后呢,实际上呢 GFP 标记的呢是
非纯合突变的那样的克隆,这样的话我们就很容易地区分开了 然后呢进行对照分析。
好,那么 如果是我们找到一个基因
找到一个品系 就是说突变的这个很多,我们不是拿到很多突变体吗,是吧?
然后呢杂交,杂交以后呢看表型,看到一个表型呢 我们呢就跟这个,这是
Notch 相关的一个,我们上次看过那个突变表型,是吧?跟 Notch 相关的 这样的表型,这样一个果蝇我们感兴趣
但是呢这个时候呢,我们知道是它,有这样的表型 它已经是突变体了。
但是呢 我们到目前为止,我们还不知道这个基因 究竟是什么。
也就是说EMS究竟影响到 哪个基因了,才造成这样的突变的,是吧?
我们还不知道,现在,是不是?所以,接下来以后,我们就要对这个突变体进行什么
我们英文里面边叫什么,叫mapping。
然后呢,确定它的那个基因的位置是什么 好,那么常规的mapping的方法
是这样的:这里呢,就说这个 最上边这条线呢,代表的就说是
这条染色体,这儿写的是2r,我们是用的另外一个图,来 说明问题的。
就是说这个地方,如果是假设这块有一个 突变体,但是我们不知道其实第二染色体上究竟哪块有
被突变掉了,我们是不知道的,是吧?所以呢,我们要利用一些果蝇
经过杂交,就可以判断。
也就是说,你去查 这条染色体上,比方说我们刚才是用EMS
针对的是什么,针对的是第三染色体,是吧?我们就算是第三染色体上的诱病,好
果蝇库里边,专门有一个叫什么 叫deficiency
line库,就是说,这些果蝇,你像这里边 所有的这个画、
方框里面呢,有 数字标记的这个呢,都是不同的果蝇,而这些果蝇的话,这些区间
都被删除掉了,缺失的 这些区域都是缺失的。
果蝇库里边有这样的果蝇,很多 果蝇的,它是涵盖不同的片段,不同的这个染色体区域的
好,那么它是怎么保存的呢? 它实际上就是用那个balancer来保存的,永久杂种的状态保存的
好,我们把这样的果蝇,跟 我们的突变体去杂交,一个一个试,全部跟我们的突变体去杂交,好
实际上我们用的是什么?基因互补的关系 也就是说,如果是杂交以后
后代活得很正常,说明什么呢? 跟我们的突变没关系,是吧?它互相之间是互补的
是不是?就是说,我们的突变体的这条染色体上边 有正常基因的表达。
它另外一个染色体 虽然是被大片段地删除 但是呢,我们这个突变体的这个
区域的果蝇的正常的功能都可以弥补它,所以呢 互补。
但是在这样的杂交过程当中,如果有一个
果蝇,最终出现跟我们的突变体完全相同的表型了
也是[听不清]的,好,那我们 就高兴了。
好,就这一段,正好是跟我们这个 突变,因为它们的两个相同位置呢,相当于是纯合突变,是吧?
我们都可以看到表型了,好,那我们就可以 把这个基因的区域呢,就划定在这个区段里面
好,在这个区段里边呢,我们再去库里边看 是不是有覆盖这个区间的那些deficiency
line,也是被删除的那些果蝇 然后再去跟它杂交,然后我们
第二轮的话,我们经过杂交之后,又发现这两个
删除的片段,是跟它是不互补的 所以呢,我们把这个区间呢更缩小了,是吧?
好,这个一步一步地话,我们只要是有那个区间的那个
deficiency line,我们就可以做这样的工作,好
那么,到更小的区域,我们也没有更多的 被删除的果蝇,来进行杂交,在这个时候话,我们就可以
设计引物,然后呢做PCR,然后呢送去测序
最终呢,通过测序以后,我们就可以看出这个突变来 然后就知道这个突变发生在什么地方。
那么测序以后的话 在测序图上,突变的位点表现出什么样的形态呢?
很直观地,你看,只要是
两种颜色重叠的,有一个重叠的峰出现
那个位点,就是被突变掉的,点突变 当然你在那个序列比对的时候呢,那个地方呢它肯定也是对不上的
但是呢直观地,我们看测序图的话,马上就可以看得出来了,好 做到这个时候的话,我们就
可以确定,这样一个突变体的果蝇
它的基因,究竟位于什么地方
然后呢,这个基因究竟是哪个基因,然后对应的表型呢,我们都已经知道了
实际上呢就是说,一定要把这个表型和基因型
一一对应的关系找到,这是我们最终的目的
好,这是,就是说如果
从正向遗传的角度,我们 跟朱建老师实验室合作,然后呢从翅膀上边来看
这个不同的表型筛选,相关感兴趣的基因的一个实例